2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领（lǐng）域取得（dé）重要进展（zhǎn）。2型糖尿病（T2D）的血管（guǎn）并（bìng）发症是导致2型（xíng）糖尿病致残致死的重要（yào）病（bìng）因，一直缺乏一种无（wú）创便（biàn）捷（jié）的临床途径（jìng）实（shí）现血管并发（fā）症（zhèng）的发（fā）生发展监测，达到早发现（xiàn）、早（zǎo）干预，以提高T2D病人的（de）整体生活（huó）质（zhì）量，减少卫生经济负担。

该研究入组了62例2型（xíng）糖尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观（guān）遗传标志物5hmC的分布情况进行检测，分析5hmC标志物与2型糖尿病血管并发症发（fā）生发展的相关性（xìng）。结果表明5hmC标（biāo）志物的（de）变化与（yǔ）T2D合（hé）并大血（xuè）管/微血管事件具有相关性，主（zhǔ）要涉（shè）及一些与血管生物（wù）学和糖尿病（包（bāo）括胰岛素耐受和炎症反（fǎn）应）相关的（de）基（jī）因和信号（hào）通路（lù）。该研究建立的（de）16个（gè）基因-5hmC标志物（wù）组合检测可（kě）以准确区分有并发症和无并发（fā）症的（de）2型糖（táng）尿病病人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明（míng）显优于传统临床变量例如白蛋（dàn）白（bái）尿。除此（cǐ）之外，还建立（lì）了13个（gè）基（jī）因（yīn）-5hmC标（biāo）志物（wù）组合检（jiǎn）测（cè），可以（yǐ）进一（yī）步（bù）区分T2D合并（bìng）单（dān）一并发症（zhèng）和多（duō）种（zhǒng）并发症（zhèng）[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他传统临床变量。该研（yán）究得（dé）出结（jié）论，5hmC标志物反映（yìng）了（le）T2D病人大血管/微血管并发症发生过程中的（de）表观遗传（chuán）变化，因而5hmC-Seal检（jiǎn）测（cè）技术在监测糖尿（niào）病血管并发症发生和进展方面具（jù）有良（liáng）好的临（lín）床应用前景。

本研究共（gòng）纳入62例（lì）2型（xíng）糖尿病病人，包括没有血管并发症的病人12例，有（yǒu）单（dān）一血（xuè）管并发症的（de）病人34例（24例（lì）发生大血管事件，10例发生微血管（guǎn）事件），以及（jí）有多种血（xuè）管并发症的病人16例。试验收集62例病人（rén）血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技（jì）术捕获外周血cfDNA中（zhōng）的5hmC序列，进行二代（dài）测序，通过生物信息学分析（xī）找（zhǎo）出并发症组与无并发症组之间有显著5hmC修（xiū）饰差异（yì）的基因（yīn），单（dān）一（yī）并发症组和多种并发症组之（zhī）间有显著5hmC修饰差（chà）异（yì）的基因。随后利（lì）用回归模型对差异基（jī）因进一步筛选、优化，弹性网络进一步（bù）筛选（xuǎn），计算（suàn）加权平均分，最后得到一组具（jù）有高度灵（líng）敏度和特异性的5hmC生物标记物，并进一步在（zài）实（shí）验组中验证，分析（xī）其灵敏（mǐn）度和特（tè）异（yì）性。并将新建立（lì）的5hmC标志（zhì）物基因组合的检测性（xìng）能与传统临床变量进（jìn）行对比（bǐ）分析。最（zuì）后对相关基因进行了信号通（tōng）路分析和功能探究。

5hmC修饰水平与血管并发症（zhèng）具有相关（guān）性

利用（yòng）逻（luó）辑回归模型对62例有（yǒu）并发症（zhèng）和无并发症（zhèng）2型糖尿病病（bìng）人的5hmC差异水（shuǐ）平（píng）进行分析发现，有并发症2型糖尿病病人的（de）622个差异修饰候（hòu）选基因（包括（kuò）上调和下调基因）的（de）归一化平均数要明显高于无并发（fā）症的病人（P<0.001），但是单一并发症（zhèng）和多发并发症病人（rén）之间没有（yǒu）显著差（chà）异。

之后将（jiāng）有单一并（bìng）发症或多种并发症的50例病（bìng）人用逻辑回归模（mó）型进（jìn）行（háng）了对比，发现多种并发症的病人的153个差异修饰候选（xuǎn）基因（包（bāo）括上调和下调基因）的归一（yī）化平均数要低于无并（bìng）发症病（bìng）人（rén）（P<0.001）。

5hmC标志（zhì）物（wù）可区分有（yǒu）无并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性（xìng）网络筛选后发（fā）现，16基因-5hmC标志物组合（hé）检（jiǎn）测（cè）可（kě）以（yǐ）用于区分有并（bìng）发症和无并发（fā）症的2型糖尿病病（bìng）人（rén）。

基于16基因（yīn）组合模型 (Detection Model 1) 的（de）加权平均分分析（xī），发现无（wú）并发症病（bìng）人的分数在训（xùn）练集和测试集中都明显低于有（yǒu）并发症的病（bìng）人。只考虑加权平均分的话，受试者工作特（tè）征曲（qǔ）线（xiàn）（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在（zài）测试组中中的灵敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标志物可区分病人是单一并发症还是多种并（bìng）发症

50例有并发症的2型糖尿病病人（rén）被随机分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网（wǎng）络筛选（xuǎn）后发现（xiàn），13基因-5hmC标志物组合可以区分（fèn）2型糖尿病病人是否发生单一并发症或多种（zhǒng）并发症。

基于（yú）13基因（yīn）组合模（mó）型（xíng） (Detection Model 2)， 我们（men）计算了单一并发症和多种并发（fā）症的加权平均分，发现在（zài）训练集和（hé）测试（shì）集中单一并发症和多种并发症病人（rén）的（de）分数都有明显差异。值得一提（tí）的（de）是，有肾病并发症和无肾病并发症病人的分数也有明（míng）显差异。利用加权（quán）平（píng）均分作为（wéi）判断标（biāo）准的受试者（zhě）工作特征曲（qǔ）线（xiàn）（ROC）表明，在测试（shì）组中当将cutoff值设成（chéng）0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标（biāo）志物与（yǔ）传统临床（chuáng）变量/危险因（yīn）子的对比（bǐ）

我们评（píng）估了不同临床（chuáng）变量/危险因子用于（yú）监测血管并发症的灵敏度和特（tè）异（yì）性（见表1）。

信号通路分析和功能探究

有并发症和（hé）无并发症病（bìng）人的135个差（chà）异候选基因的功能注（zhù）释分析表明，这些基因（yīn）主要（yào）富集（jí）在一些经（jīng）典的信号（hào）通路。错误发现率相关（guān）P值位（wèi）于前10%和基因数目≥3的（de）信号（hào）通路包括由IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所介导的信号通（tōng）路。由IGF1R和IL-10介导的信（xìn）号通路与胰岛素抵抗及炎（yán）症（zhèng）反应相关，在血管生物学和糖尿病（bìng）发（fā）生发展（zhǎn）过程中发挥重要作用。

Reactome相互（hù）作用（yòng）网络的中（zhōng）心表明，泛素编码（mǎ）基（jī）因（yīn）[泛（fàn）素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖体蛋（dàn）白融合产物1(UBA52)]是（shì）候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要（yào）连接（jiē）者。在这135个差异（yì）候选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关的倾向，表（biǎo）明5hmC和糖尿病血（xuè）管（guǎn）并发症之间可能存在时间（jiān）依赖性的（de）相互（hù）作（zuò）用。基于纵向时间队列的大样本研究，将可进（jìn）一（yī）步（bù）明确（què）5hmC变（biàn）化和糖（táng）尿病持续时间（jiān）之间的动态关联。关（guān）于单一（yī）并（bìng）发症和多种并发症病人的159个候选标（biāo）志（zhì）基因（yīn）的功能注释研究（jiū）发现，存在细胞-细胞（bāo）连接（jiē）、胶原（yuán）蛋白形成、新（xīn）陈代谢、细胞应激应答信号通（tōng）路（lù）的富集（jí），这（zhè）些信号通路均与细胞基（jī）本功能（néng）密切相关。

血管（guǎn）并发症是三分（fèn）之二糖（táng）尿（niào）病（bìng）病人的死亡原因，若能及早有效控制血管并发（fā）症的发生，将极大地改善（shàn）糖尿病病人（rén）的生存（cún）质量。该研究（jiū）建立了（le）一种利（lì）用cfDNA进行2型（xíng）糖尿（niào）病血（xuè）管并发症监（jiān）测的无创便捷方法，较目前临床标志物能更准确地监控血管并发（fā）症的发（fā）生，从（cóng）而提示临床及（jí）早采（cǎi）取应对措施，有（yǒu）效控制病情（qíng）进展。